I – ĐẶC ĐIỂM VÀ THÀNH PHẦN CỦA HÓA CHẤT HUYẾT HỌC
1. Hóa chất huyết học

Hóa chất huyết học sử dụng trong phân tích tế bào máu đó là các hóa chất pha loãng, trong đó bao gồm các thành phần:
– Muối vô cơ
– Đệm vô cơ và đệm hữu cơ
– Chất hoạt động bề mặt
– Chất bảo quản
Độ pH được điều chỉnh dao động từ 6.0 – 8.0, áp suất thẩm thấu nằm trong khoảng 200 – 400 miliosmoles.

Hóa chất huyết học có tác dụng pha loãng tế bào máu khi phân tích, đồng thời giúp duy trì ổn định tế bào hồng cầu trong buồng đếm hồng cầu, ly giải tế bào hồng cầu để dễ dàng phân tích bạch cầu trong buồng đếm bạch cầu.
Hóa chất huyết học có một số đặc tính sau:
1. Có tính dẫn điện: bởi vì có các thành phần các chất điện giải
2. Có tính đẳng trương: giúp duy trì ổn định hình dạng, kích thước của tế bào hồng cầu
3. Thành phần chất ly giải hồng cầu không gây hại, cũng như không làm bất hoạt tế bào bạch cầu
4. Bảo tồn cấu trúc Hemoglobin sau khi ly giải hồng cầu bằng Cyanmethemoglobin, để phép đo Hb là chính xác nhất.
5. Độ pH=7.4, áp suất thẩm thấu: 312 mOsm (bằng với pH và áp suất thẩm thấu của máu)

2. Đặc tính của muối vô cơ
Muối vô cơ thường là hỗn hợp của NaCl và Na2SO4, vai trò của chúng là:
– Tạo ra áp suất thẩm thấu bằng với áp suất thẩm thấu của máu
– Cung cấp các chất điện giải, giúp dung dịch có tính dẫn điện
3. Đặc tính của đệm vô cơ
– Thành phần đệm vô cơ là cặp NaH2PO4 và Na2HPO4.
– Vai trò của đệm vô cơ là:

  • Giúp ổn định, duy trì pH=7.4 của dung dịch, để cân bằng với pH máu
  • Kết hợp với chất hoạt động bề mặt giúp phân tách các cụm tế bào máu, chống kết dính giữa các tế bào, ngăn chặn tế bào bám dính vào thiết bị/buồng đếm/ống dẫn,…

4. Đặc tính của chất hoạt động bề mặt
– Thành phẩn của chất hoạt động bề mặt gồm: n-Dodecyl-D-Maltoside, n-Tetradecyl-D-Maltoside, n-Dodecyl-D-glucopyranoside, n-Decyl-D-glucopyranoside.

– Vai trò của chất hoạt động bề mặt:

  • Tăng cường độ hòa tan và độ ổn định của dung dịch đẳng trương
  • Làm giảm sức căng bề mặt
  • Ngăn ngừa hình thành bọt khí
  • Phân tách hồng cầu và tiểu cầu

5. Đặc tính của chất bảo quản
Thành phần Proclin trong chất bảo quản, giúp ngăn chặn sự sinh sống và phát triển của vi khuẩn và nấm mốc.

II – MÔ TẢ HOẠT ĐỘNG PHÂN TÍCH TẾ BÀO MÁU CỦA MÁY HUYẾT HỌC SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP LASER
1. Phân tích hồng cầu (RBC) và tiểu cầu (PLT)
– Tại buồng đếm RBC/PLT, các hồng cầu hình đĩa lõm 2 mặt và tiểu cầu hình đĩa lồi 2 mặt được xử lý cầu hóa đẳng tích bằng SDS và được cố định hình dạng hình cầu bằng Glutaraldehyde, nhằm loại trừ sai sót do những tư thế khác nhau của hồng cầu/tiểu cầu khi đi ngang qua điểm đo.
– Sau khi xử lý, hồng cầu/tiểu cầu có dạng hình cầu nhưng vẫn giữ thể tích ban đầu, nhờ dạng hình cầu mà máy có thể đo ở mọi tư thế mà vẫn đảm bảo phản ánh đúng thể tích.
PHÂN TÍCH HỒNG CẦU

– Hồng cầu khi đi ngang qua điểm đo, được chiếu nguồn Laser 670 nm, ánh sáng sau đó được phân tán thành nhiều hướng. Máy phân tích tán xạ ở 2 góc:

  • Góc hẹp 2-3 độ: phản ánh thể tích hồng cầu (CV-Cell volume)
  • Góc rộng 5-15 độ: phản ánh hàm lượng HGB trong hồng cầu (CH-Cell hemoglobin).
– Tín hiệu thu được trên mỗi góc là cặp dữ liệu liên quan đến mỗi hồng cầu đi ngang qua điểm đo và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie.

– Thông qua dữ liệu ghi được sẽ đưa ra các thông số về hồng cầu như sau:

  • RBC: là tổng số tín hiệu đếm được trong ngưỡng quy định
  • HC (nồng độ hemoglobin, đơn vị g/dL) = CH/CV
  • HCT (thể tích khối hồng cầu) = tổng các CV
  • MCV (thể tích trung bình hồng cầu): trung bình cộng của các CV
  • MCH (hàm lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu): tổng các CH
  • CHCM hay MCHC (nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu): trung bình cộng của các CH
  • HDW (Hemoglobin distribution width): độ phân bố nồng độ hemoglobin
  • CHDW (Content hemoglobin distribution width): độ phân bố hàm lượng hemoglobin

Lưu ý 3 thông số MCV, MCH và MCHC là các thông số đo trực tiếp, chứ không tính toán dựa trên hemoglobin như đa số các hệ thống huyết học dùng nguyên tắc kháng trở điện.

– Biểu đồ chính trình bày sự phân bố và tương quan giữa CV và CH; còn có các biểu đồ trình bày sự phân bố của CV, CH, HC. Biểu đồ chính sẽ xếp loại tế bào theo tiêu chuẩn:
  • Hồng cầu nhỏ (micro): CV < 60 fL
  • Hồng cầu to (macro): CV > 120 fL
  • Hồng cầu nhược sắc (hypo): CH < 28 g/dL
  • Hồng cầu ưu sắc (hyper): CH > 41 g/dL
– Có thể xem được các thông số phụ là % số tế bào được xếp loại là micro, macro, hypo và hyper.
Dựa trên các thông số % phụ này mà các cảnh báo về hình thái tế bào (morphology flag) sẽ được đưa ra khi thỏa các điều kiện quy định trước cho các loại cảnh báo này: ANISO (hồng cầu to nhỏ không đều), macro, micro; HCVAR (nồng độ hemoglobin hồng cầu không đều), hypo, hyper.

– Ngoài ra còn các cảnh báo hình thái khác liên quan đến hình dạng bất thường của hồng cầu hoặc các loại nhiễu có thể có : RBC fragments (mảnh vỡ hồng cầu), RBC Ghosts (bóng ma hồng cầu), NRBC (hồng cầu nhân). Các ngưỡng quy định cho cảnh báo hình thái đều có thể thay đổi được do người sử dụng.

PHÂN TÍCH TIỂU CẦU
– Tiểu cầu đi ngang qua điểm đo, được chiếu nguồn Laser 670 nm. Tiểu cầu được khảo sát 2 chiều ở ngưỡng thấp, phân tích tán xạ ở 2 góc:

  • Góc hẹp 2-3 độ: phản ánh kích thước tiểu cầu
  • Góc rộng 5-15 độ: phản ánh mật độ tế bào (Cell density)

Tín hiệu thu được trên mỗi góc là cặp dữ liệu liên quan đến mỗi tiểu cầu đi ngang qua điểm đo, theo nguyên tắc khảo sát từng tế bào cell by cell, và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie như khảo sát hồng cầu.

– Đặc điểm của phân tích tiểu cầu là phân tích cả các tiểu cầu to (Large Platelets), nhưng nếu phân tích và đếm số lượng tiểu cầu to sẽ có nguy cơ nhầm lẫn với các tế bào bất thường khác như: mảnh hồng cầu (RBC Fragments), bóng ma hồng cầu (RBC ghost),..; cũng như kích thước các tiểu cầu to thường chống lấn, lẫn với hồng cầu, đặc biệt là hồng cầu nhỏ. Do đó cần thêm yếu tố mật độ tế bào (cell density). Tiêu chí để phân biệt tiểu cầu thực sự so với các tế bào bất thường khác căn cứ vào bảng sau:

Do đó, kết quả báo cáo số lượng tiểu cầu sẽ gồm cả tiểu cầu bình thường và tiểu cầu to, nhưng đã loại trừ đi các thành phần không phải tiểu cầu. Khi số lượng tiểu cầu to vượt quá giới hạn nhất định, sẽ có cảnh báo hình thái Large Platelets (tiểu cầu to) hay Platelet Clump (tiểu cầu kết cụm). Khi xuất hiện các mảnh hồng cầu, bóng ma hồng cầu,… với số lượng đánh kể cũng sẽ có những cảnh báo tương ứng.

2. Phân tích Hemoglobin (HGB)
– Phương pháp Laser có thể đo trực tiếp HGB trong hồng cầu mà không cần ly giải hồng cầu bằng Cyanmethemoglobin. Các thông số MCV, MCH được tính toán từ Hemoglobin đo được, được kiểm tra chéo với thông số CH và CHCM đo trực tiếp trên tế bào không ly giải. Khi 2 thông số đo có sự chênh lệch vượt quá giới hạn nhất định sẽ có những cảnh bảo của máy và nguyên nhân có thể là:

  • Mẫu có nhiều mỡ (Lipidemic), Bilirubin hay Chylomicron
  • Mẫu thử có số lượng bạch cầu cao > 60 G/L
  • Tiểu cầu kết cụm, mẫu thử ở trẻ sơ sinh
  • Sai số kỹ thuật xảy ra ở kênh Hemoglobin hoặc RBC

3. Phân tích Hồng cầu lưới (RET-Reticulocyte)
– Phương thức xử lý và phân tích tương tự như khảo sát hồng cầu, nhưng hồng cầu lưới được nhuộm với Oxazine 750 để nhuộm màu acid nucleic và khảo sát độ hấp thu chất màu này trên nguồn sáng Laser 670 nm, đối chiếu trực tiếp với kích thước và hàm lượng Hemoglobin của hồng cầu lưới. Kết quả khảo sát được, cho phép đưa ra được các thông số về hồng cầu lưới như sau:

  • Retic (Reticulocyte – hồng cầu lưới) : số lượng tuyệt đối và phần trăm % so với tổng số hồng cầu
  • CHr (hàm lượng hemoglobin hồng cầu lưới)
  • MCVr (thể tích trung bình hồng cầu lưới)
  • CHCMr (nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu lưới)

– Biểu đồ Retic chính trình bày sự phân bố và tương quan của hồng cầu lưới so với hồng cầu bình thường (HC lưới có màu xanh sáng so với HC bình thường màu đỏ).

– Biểu đồ hấp thu Oxazine 750 cho phép đánh giá chất lượng của hồng cầu lưới ở các mức L, M và H (đánh giá độ trưởng thành của HC lưới tuỳ sự hiện diện của nhân hoặc lưới RNA còn lại trong hồng cầu) cũng như các thông số phụ về % các nhóm L, M và H này.

– Các biểu đồ phụ trình bày sự phân bố các yếu tố CHr, CHCMr và CVr, có đối chiếu với sự phân bố của hồng cầu bình thường trên cùng thang đo cho dễ nhận định (HC lưới có màu xanh so với HC bình thường màu đỏ).

4. Nguyên tắc phân tích Bạch Cầu – Kênh Basophil-Lobularity
– Dựa trên nguyên tắc: Bạch cầu đoạn ưa base (Basophilic segmented) có tính đề kháng với sự ly giải hỗn hợp acid phtaleic và chất surfactant (chất hoạt hóa bề mặt). Máu toàn phần được trộn với thuốc thử (Phtaleic acid & Surfactant) làm tế bào hồng cầu và bào tương của các loại tế bào khác bị ly giải, ngoại trừ bạch cầu đoạn ưa base, chỉ còn lại tế bào bạch cầu base và nhân các tế bào bạch cầu khác.

– Hỗn hợp mẫu thử được phân tích trên cùng hệ thống quang học như phân tích hồng cầu: nguồn sáng là Laser diod 670nm, phân tích tán xạ:

  • Góc hẹp 2-3 độ: phản ảnh kích thước bạch cầu
  • Góc rộng 5-15 độ: phản ảnh độ phức tạp của nhân bạch cầu (số múi nhân).

– Kết quả được trình bày trên biểu đồ Baso, đối chiếu kích thước bạch cầu và độ phức tạp của nhân, sử dụng ranh giới động (điểm lõm xuống thấp nhất, phân chia hai quần thể tế bào khác nhau) để ghi nhận số lượng basophil, số tế bào đơn nhân và đa nhân.

5. Nguyên tắc phân tích Bạch Cầu – Kênh Peroxidase
– Để có đầy đủ các thành phần bạch cầu, thì thông tin của riêng kênh Basophil-Lobularity là chưa đủ, do đó cần phối hợp thêm với một kênh phân tích khác, đó là kênh Peroxidase.
– Peroxidase có trong nhiều loại bạch cầu khác nhau. Dựa vào đó, tiến hành nhuộm Peroxidase bằng hỗn hợp Hydrogen peroxide và chất màu thích hợp. Sau khi nhuộm, Peroxidase tạo ra một chất màu đậm bên trong bạch cầu. Phương pháp này cho phép phân lập rõ Monocyte khỏi nhóm Neutrophil cũng như nhóm các tế bào to không bắt màu LUC (Large Unstained Cell). Do đó kênh Peroxidase cho phép đếm chính xác 3 nhóm bạch cầu bắt màu (Neutrophil, Eosinophil và Monocyte) và 2 nhóm không bắt màu (Lymphocyte và LUC):
  • Neutrophil và Eosinophil được nhận biết do có hoạt tính peroxidase rất cao, nhưng có thể phân biệt hai loại tế bào này nhờ sự khác biệt về kích thước.
  • Monocyte chứa một hàm lượng thấp peroxidase, nên có thể phân biệt thành một quần thể riêng biệt, tách khỏi nhóm LUC, nhưng có thể lẫn với một số tế bào Neutrophil chứa quá ít peroxidase trong bào tương.
  • Quần thể Lymphocyte chứa cả Lymphocyte lẫn Basophil, do đó cần phải trừ ra từ số lượng Basophil đếm được trên kênh Basophil-Lobularity.
– Kỹ thuật nhuộm màu Peroxidase trong bạch cầu: máu toàn phần được lần lượt trộn với 3 thuốc thử:
  • Ở bước 1: hồng cầu bị ly giải, còn các tế bào bạch cầu được bảo tồn.
  • Ở bước 2 và 3: Neutrophil, Eosinophil và Monocyte được nhuộm màu peroxidase, còn Lymphocyte, Basophil và LUC không bắt màu.
– Hỗn hợp mẫu thử được phân tích trên hệ thống quang học với nguồn sáng Tungsten, phân tích tán xạ góc hẹp 2-3 độ phản ảnh kích thước bạch cầu và độ hấp thụ quang phản ảnh độ bắt màu (hoạt tính) peroxidase của bạch cầu.
– Kết quả được trình bày trên biểu đồ Perox, đối chiếu kích thước bạch cầu và hoạt tính peroxidase của bạch cầu, sử dụng ranh giới động (điểm lỏm xuống thấp nhất phân chia hai quần thể tế bào khác nhau) để ghi nhận số lượng từng quần thể bạch cầu: Neutrophil, Eosinophil, Monocyte, LUC, và tổng của Lymphocyte + Basophil.
– Dữ liệu thu được từ 2 kênh Basophil-Lobularity và Peroxidase cho phép đưa ra các thông số về bạch cầu như sau:
  • Số lượng bạch cầu: dựa trên số lượng đếm được trên kênh Peroxidase (thông số WBCP), so sánh với số lượng đếm được trên kênh Basophil-Lobularity (thông số WBCB).
  • Số lượng tuyệt đối và phần trăm % các thành phần bạch cầu: Neutrophil, Eosinophil, Basophil, Lymphocyte, Monocyte và LUC.
  • Chỉ số múi nhân (LI – Lobularity Index) và chỉ số hoạt tính Peroxidase (MPXI – Mean Peroxidase Index
– Các cảnh báo hình thái khác liên quan đến sự phân bố bất thường của bạch cầu, bao gồm:
  • LEFT Shift (công thức bạch cầu chuyển trái, do gia tăng số múi nhân của bạch cầu hạt)
  • IG-Immature Granulocyte (bạch cầu hạt chưa trưởng thành, tức là dạng Band)
  • ATYP-Atypical Lymphocyte (lymphocyte không điển hình, đặc trưng thường thấy khi nhiễm siêu vi)
  • BLAST (nghi ngờ có các tế bào đầu dòng bất thường).
– Điểm đặc biệt là hai thông số WBCB và WBCP được kiểm tra chéo với nhau. Máy phân tích sẽ cảnh báo khi 2 thông số đo có sự chênh lệch vượt quá một giới hạn nhất định và thường do một trong các nguyên nhân sau:
  • Bệnh lý khiếm khuyết men Myelo-peroxidase di truyền hay mắc phải, có thể gặp ở tần suất cho đến 0.5%. Trong trường hợp này sẽ có xu hướng giảm WBCP.
  • BUN (Urea Nitrogen) máu rất cao (> 200-250 mg/dL) làm ly giải không hoàn toàn hồng cầu, nên có xu hướng làm tăng WBCP.
III – TIÊU CHÍ ĐẢM BẢO HÓA CHẤT VÀ MÁY HUYẾT HỌC HOẠT ĐỘNG TỐT
1. Background (Chạy trắng)
 – Khi khởi động máy đầu ngày, kết quả background lý tưởng phải cho ra WBC, RBC, PLT, HGB bằng 0. Điều này cho thấy hóa chất đạt độ tinh khiết, cũng như chứng tỏ các tế bào màu không còn sót lại trên đường ống, buồng đếm,…
2. Giá trị kiểm chuẩn
– Phải vượt qua được kiểm tra chất lượng hệ thống, kiểm tra này đánh giá khả năng đo và sai số hệ thống. Như vậy hóa chất cần đạt hoặc tiệm cận điểm vàng “Gold Point”, để hạn chế thấp nhất sai số hệ thống có thể xảy ra.
3. Độ lặp lại
– Độ lặp lại tốt khi kết quả phân tích nhiều lần trên cùng 1 mẫu, trong khoảng thời gian nhất định thu được các kết quả như nhau. Và theo thời gian, vẫn phải đảm bảo độ lặp lại này.
4. Lỗi Clog
– Được hiểu là do hóa chất mà thiết bị vận hành không đạt như mong muốn, thiết bị chỉ đo được một phần trong tất cả các thông số cần đo.
– Hóa chất huyết học tốt chứa các chất phụ gia hỗ trợ cho hệ thống vận chuyển hoạt động êm ái, các yêu cầu đó là:
  • Làm mềm các đường ống và hệ thống truyền động
  • Có lực căng nhất định để hóa chất không thấm qua xilanh, ống dẫn
  • Không làm xơ cứng hệ thống truyền động, van, xilanh, ống dẫn.
 5. Không hòa tan không khí, bọt khí
– Hóa chất tốt phải đảm bảo không hòa tan không khí, bọt khí. Nếu xuất hiện bọt khí trong hóa chất, bọt khí sẽ theo vào các ống dẫn, làm tắc hoặc ngăn dòng chảy liên tục của hóa chất khi phân tích, gây sai lưu lượng. Đồng thời, hóa chất có bọt khí tạo cơ hội cho vi khuẩn hiếu khí phát triển, làm hỏng hóa chất.
6. Đảm bảo tính tương thích với đa số các máy phân tích huyết học cả Laser và trở kháng.
Lê Văn Công

Tư vấn mua sắm sử dụng thiết bị xét nghiệm phù hợp

Thiết kế phòng xét nghiệm tiêu chuẩn.

Website: https://xetnghiemyhoc.com/

Email: thietbixetnghiemyhoc@gmail.com

Fanpage:

https://www.facebook.com/thietbihuyethoc/

https://www.facebook.com/thietbixetnghiemhoasinh/

https://www.facebook.com/thietbixetnghiemvisinh/

Hotline:

Huyết học: Mr. Công: 0362.539.827

Hóa sinh, Vi sinh: Mr. Quang: 0981.109.635

Thiết kế PXN: Mr. Tuyến: 0978.336.115

 

Tài liệu tham khảo:
1. Công ty hóa chất xét nghiệm Hema
2. Bệnh viện Đức Giang